メインキャラクター
- マリオ
主人公。
さらわれたピーチ姫を助けるための冒険に出る。
- ルイージ
対戦ゲーム「マリオVSルイージ」で登場。
マリオじゃない方のプレイヤーキャラクター。
- ピーチ
クッパJr.にさらわれる。
- クッパ
メイン悪役(黒幕)。
クッパJr.にピーチ姫をさらわせる。
今作では炎に落ちたことにより"ほねクッパ"と化す。
- クッパJr.
ピーチ姫をさらう。
味方キャラクター
- 巨大ハナチャン
ワールド7に登場する巨大なハナチャン。
4画面ほどの大きさがあり、上に乗って進むことが出来る。
ただし、足場が不安定。
- ドッシー
ゴーグルをした首長竜。
4-1と4-6に登場する。
ヒップドロップすると首を下げて速くなる。
- キノじい
キノピオの家にいて、そこで各種アイテムをくれる。